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  实时荧光定量 PCR(real-time PCR)技术和普通 PCR 相比,准确性和灵敏度高,速度快,效率高,近年来被广泛应用于医学、生物等各个领域,是进行分子生物学研究必不可少的技术工具。在科研方面可定量分析各种基因的的表达分析,基因突变和多态性分析,单核苷酸多态 SNP 测定及易位基因的检测;在医疗方面可用于免疫组化分析临床疾病早期诊断,病原体检测,耐药性分析,肿瘤微小残留病变研究,细胞因子的表达分析,病毒感染的定量检测等。

  在整个荧光定量 PCR 实验设计中,引物的设计是实验成功的关键因素,很大程度决定了检测的灵敏度和准确性,一般 real-time PCR 引物的设计应遵循如下原则:

  4. 引物长度:一般在 17-25 碱基之间,上下游引物不宜相差太大。引物长度是决定退火温度(Tm 值)zui重要的因素。一般来讲,每增加一个核苷酸可使引物特异性提高 4 倍,但是由于熵的原因,引物越长,它退火结合到靶 DNA 上形成供 DNA 聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。

  7. 引物 G+C 含量在 40%~60% 之间,45-55% zui好。引物中碱基要随机分布,尽量均匀,若是引物存在严重的 GC 倾向或 AT 倾向则可以在引物 5』端加适量的 A、T 或 G、C 尾巴来平衡一下。

  8. 引物 Tm 值在 58-62 度之间,上下游引物 Tm 值不宜相差太大,zui好不要超过 5 度。如果引物碱基数较少,可以适当提高退火温度,提高 PCR 的特异性;如果碱基数较多,那么可以适当减低退火温度,使 DNA 双链结合。

  9. 引物 5端可以修饰;引物 5端一般不会影响扩增的特异性,可进行修饰,如加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入突变位点、插入与缺失突变序列等。

  10. 引物 3端不可修饰,引物 3』端是延伸开始的地方,决定扩增的特异性。3』端应避开连续的 T/C,A/G(2-3 个);也不能有形成任何二级结构。

  11. 引物 3端要避开密码子的第 3 位。因为密码子的兼并性,因密码子的第 3 位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。

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